ТРИХОДЕРМА - ПРОДУЦЕНТ ИНГИБИТОРА ВИРУСА

[Heretic]

http://medi.ru/pbmc/8800406.htm

 

ТРИХОДЕРМА - ПРОДУЦЕНТ ИНГИБИТОРА ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

 

СМИРНОВА И.П., АЛЕКСЕЕВ С.Б., МОШКОВ Д.А.

Кафедра биохимии Российского Университета дружбы народов

 

Сопоставлено ингибиторное действие белка из триходермы и азидотимидина на репрадукцию вируса СПИДа. Полученные данные свидетельствуют о том, что белок из триходермы может служить ингибитором вируса СПИДа.

 

Ключевые слова: L-лизин-a-оксидаза, вирус иммунодефицита человека, триходерма.

 

В настоящее время поиск средств лечения самого опасного заболевания человека - СПИД, - является первоочередной задачей многих исследований. Испытания на возможность ингибировать вирус иммунодефицита человека проводятся с веществами самого разнообразного строения, в том числе и с веществами микробного происхождения [1-4].

 

В связи с этим представляло интерес исследовать изученный ранее штамм Trichoderma harzianum Rifai - продуцент антиопухолевого фермента L-лизин-a-оксидазы [5] на способность ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека и сравнить продукт биосинтеза этого гриба на антивирусную активность с широко используемым в качестве ингибитора ВИЧ азидотимидином [6].

 

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовали штамм Trichoderma harzianum Rifai, выращенный по описанному ранее методу [7]. Гомогенный (по данным гель-электрофореза и ультрацентрифугирования) фермент штамма триходермы L-лизин-a-оксидазa с удельной активностью 81 Е/мг был получен ранее разработанным нами способом [8]. Определение активности фермента из триходермы проводили спектрофотометрическим ортодианизидиновым микрометодом [9]. Клетки линии МТ-4 (культивируемые Т-лимфоциты человека), клетки линии Jurkat (лимфобластоидная линия человека) выращивали на среде RPMI-1640, содержащий 10% сыворотки теленка и 100 ед./мл ампициллина. Подсчет клеток проводили в камере Горяева, определяя количество мертвых клеток с помощью окрашивания трипановым синим.

 

Заражение клеток ВИЧ осуществляли следующим образом: вирус (штамм IIIB/H9) вносили в суспензию клеток МТ-4 в количестве 100,000 цитопатических доз (ЦПД) на 500,000 клеток. За размножением вируса следили по наличию в культуральной среде вирусных антигенов и развитию динамики цитопатического действия вируса на клетки. Стандартным считали наличие мертвых клеток в контроле не более 5%. В клетках, зараженных вирусом, ЦПД отмечали при наличие не менее 10% мертвых клеток. Присутствие в культуральной среде вирусных антигенов определяли с помощью сыворотки крови больного СПИД. Сыворотка содержала антитела против продукта гена gag белка p24 и продуктов гена enu gp41 и gp120 вируса иммунодефицита человека I типа.

 

Иммуноглобулины выделяли из сыворотки на сорбенте DEAE-Affi-Gel Blue в соответствии с прилагаемой инструкцией фирмы Bio-Rad (США). Часть выделенных IgG конъюгировали с пероксидазой хрена периодатным методом по стандартной методике. Титр конъюгата определяли по оптической плотности при 492 НМ в результате протекания цветной ферментативной реакции в растворе следующего состава: 10 мг о-фенилендиамина в 24 мл 0,1 М фосфатно-цитратного буфера рН 5,0 и 10 мкл перекиси водорода (33%). В лунку вносили 100 мкл раствора и через 10 мин реакцию останавливали 100 мкл 2М серной кислоты. За титр конъюгата принимали такое разведение, при котором оптическая плотность составляла 1,2 оптические единицы, что соответствовало разведению конъюгата 1:800. Сорбирование иммуноглобулинов в ячейки 96-луночного планшета производили по 1 мкг в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 в течении 18 часов. Далее в лунки вносили 100 мкг испытуемого образца, приготовленного следующим образом: культурную среду клеток МТ-4, зараженных вирусом, разводили в 3 раза в натрий-фосфатном буфере рН 7,0, содержащем 0,1 М NaCl, 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,5% Твин-40. После часовой инкубации планшеты промывали 3 раза тем же буфером без БСА, инкубировали с конъюгатом в течении 1 часа и окрашивали как описано выше. За титр принимали такое разведение, при котором оптическая плотность в лунке была в 3 раза выше чем в соответствующем контроле (культурная среда клеток МТ-4, незараженных вирусом).

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Предварительно определяли токсическую дозу белка триходермы для клеток МТ-4. Сравнение проводили со стандартным препаратом - азидотимидином, который вызывает подавление репродукции вируса в концентрации 3 мкМ (1,2 мкг/мл).

 

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют, что нетоксическая доза фермента находится в диапазоне концентраций 0,7-70 нг/мл.

 

Азидотимидин вызывает полное подавление репродукции вируса в дозе 1,2 мкг/мл. Такой же эффект достигается при применении белка триходермы в концентрациях от 7,0 до 70 нг/мл. При более низких концентрациях белка видно, что наблюдается частичное уменьшение титра вируса по сравнению с контрольными культурами.

 

 

Результаты исследования антивирусного действия белка триходермы представлены в таблице 2.

 

Таким образом, высокоочищенный белок Trichoderma harzianum Rifai в концентрациях 7,0-70 нг/мл полностью блокирует репродукцию ВИЧ, не оказывая токсического воздействия на клетки МТ-4.

 

Можно также отметить, что для достижения при использовании белка триходермы антивирусного действия требуется гораздо более низкие концентрации по сравнению с азидотимидином. Полученные данные антивирусной активности белка триходермы были подтверждены в экспериментах по изучению его воздействия на синтез вирусных антигенов в зараженных клетках. Результаты иммуноферментного тестирования вирусных антигенов при наличии и отсутствии ингибитора представлены в таблице 3.

 

Таблица 3. Сравнение влияния азидотимидина и белка триходермы на синтез вирусных антигенов, выявляемых в культуральной среде зараженных вирусом клеток МТ-4

Данные, представленные в таблицах 2 и 3, позволяют сделать вывод, что белок, выделенный из Trichoderma harzianum Rifai ингибирует как репродукцию вируса иммунодефицита человека, так и синтез вирусных антигенов и могут представлять интерес в дальнейших научных исследованиях.

 

ЛИТЕРАТУРА

 

1. Quinn T.C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2407-2414.

2. Wasserheit J.N. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2430-2435.

3. Березов Т.Т., Алексеев С.Б., Смирнова И.П., и др. (1994) Патент РФ № 2022011.

4. IX-th International Congress of Virology. Part. 26 Chemotherapy (1993) Glasgow. - Abstracts. 203-210.

5. Хадуев С.Х., Глазкова Т.Ю., Веса В.С., и др. (1989) Бюл. экспер. биол. мед. № 10, 476-477.

6. Mitsuya M., Broder S., et. al. (1987) Nature, 325, 773-778.

7. Kusakabe H., Kodama K., Kuninaka A., et. al. (1979) Agricult. Biol. Chem., 43, 2531-2535.

8. Хадуев С.Х., Лукашева Е.А., Смирнова И.П., Березов Т.Т. (1985) Вопр. мед. химии, 31 (5), 130-134.

9. Смирнова И.П., Сяткин С.П., Березов Т.Т. (1984) Вопр. мед. химии, 30 (1), 133-136.

 

Поступила 18.06.97.

 

TRICHODERMA RIFAI AS HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INHIBITOR PRODUCER

 

I.P. SMIRNOVA, S.B. ALEXEEV, D.A. MOSHKOFF

Department of Biochemistry, Peoples Friends hip University, Mosсow

 

The ability of protein isolated from (Trichoderma Rifai) and azydothymidine to inhibit the reproduction of HIV-virus was compared. The obtained experimental data have verified that Trichoderma Rifai protein is a promising human immunodeficiency virus (HIV) inhibitor.

 

Key words: Human immunodeficiency virus, Trichoderma