Агар(устаревшее название агар-агар) – продукт, получаемый из красных и бурых водорослей (таких как Eucheuma spinosum Ag., E. gelatinae Ag., Gelidium cartilagineum (Grev. и др.) и образующий в водных растворах плотный студень. Представляет собой белый, похожий на муку порошок.

  Питательная среда из зернового отвара Состав: Зерновой отвар* -100 мл**; агар - 1,5 г.*** * Можно использовать отвар, который остается у Вас после приготовления зерна (если Вы используете зерно в качестве субстрата), но только если зерно варилось без добавления Н2О2. В противном случае, агар попросту не застынет. **Расход среды на одну 100 мм чашку Петри ~ 30-50 мл. *** При использовании девятисотого агара.

  Получившийся отвар необходимо профильтровать. В качестве фильтра можно использовать сложенную в несколько слоев марлю, или хлопчатобумажную ткань. Их укладывают в сито или воронку и аккуратно выливают отвар.

Если количество отвара получилось меньше, чем Вы рассчитывали, доведите его до нужного объема долив необходимое количество воды (используется обычная вода из-под крана).

  Получившийся отвар переливаем в небольшую емкость

ставим на газ, доводим до кипения и уменьшаем огонь.

Добавляем необходимое количество агара, постепенно* высыпая его в кипящий отвар. *(Если агар высыпать сразу, он слипнется в комок, который будет потом очень нелегко растворить в жидкости)

Размешивая, снова доводим отвар до кипения.

Продолжая постоянно помешивать, добиваемся ПОЛНОГО растворения агара. Как только это произойдет - среда готова

После приготовления, тут же разливаем готовую среду по чашкам Петри. (Чашки Петри сделаны из закаленного стекла, поэтому они не лопнут.)

Наливать среду, следует слоем 3-5 мм.

После этого накрываем чашки Петри,

 

и установив их одна на другую в какую-нибудь тарелку или блюдце, (так будет удобнее переносить их с места на место)

ставим в скороварку (или кастрюлю)наливаем 2-3 см воды на дно скороварки(технология -обработка текучем паром)

и стерилизуем в течение 1 часа.!! но я бы советовал вам сделать 2 раза дробно по 25 минут после закипания с паузой в 24 часа меж обработками.

  когда скороварка остынет ,  подготавливаем иннокуляционные петли !

Берем самую длинную, какую сможем найти иглу (замечательно подходит "набор игл для шитья кукол"),

или проволку нержавейку или нихром (серебро не подходит!!!)

нагрейте кончик иглы(проволки ) до красна и сплющите немного 1-2 см

потом снова нагрейте кончик заготовки и согните под 90градусов,обмотайте место для ручки синей изолентой чтоб на века!))

  Аккуратно, стараясь не сдвигать крышки, вынимаем чашки Петри из остывшей скороварки, и откачиваем шприцем воду скопившеюся в блюдце. Конденсат образовавшийся внутри, на крышках чашек Петри, опасности не представляет.

 

Работы по проведению инокуляции, должны проводиться в стерильных условиях!Для этого, все необходимые инструменты (инокуляционную петлю, скальпель, вату, спирт, горелку и т.д.), а так же приготовленные чашки Петри, переносят в помещение, которое затем, в течение некоторого времени* обрабатывают бактерицидной лампой. *(30-60 мин., зависит от площади помещения и мощности лампы.)   Зайдя в помещение, расставляем инструменты так, чтобы нам было удобно работать. Протираем спиртом все поверхности

Инокуляционную петлю погружаем в спирт,

и прокаливаем ее докрасна над пламенем горелки(газовой конфорки)

Затем снова погружаем в спирт

подносим к горелке, и тут же (пока горит спирт) несем петлю к чашке Петри.

Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), погружаем инокуляционную петлю в агар*. *Это делается для того, чтобы инокуляционная петля стала липкой от оставшегося на ней расплавленного агара. (Так же, при этом происходит охлаждение инокуляционной петли до безопасной для спор температуры.)

Сразу же после этого, слегка приоткрыв пакетик с отпечатком, не касаясь его краев, соскребаем инокуляционной петлей часть спор*. *Если отпечаток хорошего качества, достаточно едва коснуться петлей, чтобы к ней прилипли тысячи спор. Если отпечаток совсем бледный, можно основательно поскрести острым концом инокуляционной петли по бумаге, чтобы вместе с частичками бумаги наверняка захватить часть спор.

После этого, сразу же переносим инокуляционную петлю обратно к чашке Петри, и так же, слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), касаемся поверхности агара в нескольких местах.

Если спор было достаточно много, они будут заметны на поверхности агара. Если спор было мало, на агаре останутся только следы от контакта с инокуляционной петлей. В любом случае, споры попали на питательную среду, в благоприятные условия, и через несколько дней должны прорасти.

Обязательно подписывайте свои чашки Петри (название вида, дату инокуляции и т.д., все, что считаете нужным), иначе потом Вы запутаетесь, что, где растет.

 

Теперь, чашки Петри необходимо обернуть пищевой пленкой. Это делается для того, чтобы предотвратить проникновение в них посторонних микроорганизмов. Накладываем пленку поверх чашки Петри,

и обрезаем ее с небольшим запасом.Теперь стягиваем края пленки вниз по всему периметру чашки Петри,

 

  и закручиваем их (как фантик).

Закрученные края плотно прижимаем рукой

и в таком виде, убираем чашки Петри в темное, теплое (23-27-29С) место, на весь период инкубации.

                                                                       *************************************

Инкубация Через 3-10 дней (в зависимости от количества и качества спор) споры прорастают - в местах инокуляции появляется белый пухмицелия.* * Мицелий любого другого цвета, или консистенции, (например пленка, или слизь) является явным признаком заражения и должен быть немедленно удален.

Через несколько дней, очагов мицелия становится больше, и он продолжает разрастаться.

Очаги мицелия могут появляться не только в местах, контакта с инокуляционной петлей, но и по всей поверхности агара. Это происходит потому, что пока Вы совершали манипуляции внутри чашки Петри, некоторые споры упали с инокуляционной петли сами по себе, и теперь они проросли. Так же, споры могли переместиться в результате движения жидкости (упавшие капли конденсата).

Если во время инкубационного периода, заражения среды посторонними микроорганизмами не происходит, через 3-4 недели, мицелий полностью осваивает поверхность агара.

  

 

     Хранение культур После того, как мицелий полностью освоит поверхность агара, чашки Петри убирают на хранение в холодильник. При температуре +3-5С процессы жизнедеятельности мицелия замедляются, и он может сохраняться в таких условиях несколько лет. В течение этого времени мицелий постепенно поедает питательную среду, поэтому, чем толще был ее слой, тем дольше мицелий сможет питаться. По мере надобности, чашки Петри с мицелием достают из холодильника и отрезают кусочки агара для проведения инокуляции*, или для пересадки культуры на свежую питательную среду.** *Для проведения инокуляции отрезают небольшой (~ 1х1 см) кусочек агара с мицелием и помещают его в емкость с субстратом. Через несколько дней мицелий перебирается на субстрат и постепенно осваивает его целиком. Фото работ по проведению инокуляции кусочками агара, можно посмотреть в иллюстрированном руководстве по выращиванию грибов. Поскольку для проведения одной инокуляции, достаточно малюсенького кусочка агара, одной 100 мм чашки Петри, хватает на проведение 20-30 инокуляций. **Такой метод хранения, называется "метод вегетативных пассажей", он позволяет сохранять полученную культуру практически в неизмененном виде. Чем реже происходит пересев, тем меньше клеточных делений претерпевает культура и тем ближе она по своим свойствам к исходному изолянту. Пересадку мицелия на новую среду, в этом случае, рекомендуется проводить не чаще одного раза в год. Для длительногохранения культур, удобно использовать пробирки со скошенным агаром. Готовую среду разливают по пробиркам, закрывают их ватно-марлевой пробкой, и после стерилизации, пока агар не застыл, устанавливают в наклонном положении - скашивают агар. После того как агар застынет, пробирки инокулируют мицелием, дожидаются полного обрастания поверхности агара, и убирают на хранение в холодильник. Длительность хранения при этом, достигается за счет уменьшении площади роста мицелия и увеличении толщины питательного слоя (по сравнению с чашкой Петри). Более подробную информацию о методе хранения культур в пробирках на скошенном агаре, а так же о выделении чистой культуры из плодового тела гриба, Вы сможете найти в тексте "Отечественные техники выращивания грибов в домашних условиях".

Выделение чистой культуры*

    * Чистая культура - это клетки микроорганизмов одного вида. (В нашем случае, это мицелий культивируемого гриба).   Если во время роста мицелия, произошло заражение среды посторонними микроорганизмами, необходимо как можно быстрее отделить чистый мицелий, от конкурирующей микрофлоры. Это можно сделать двумя способами.   1. Удаление очага заражения В случае "точечного заражения", (когда очаг заражения небольшой и локализован в одном месте), его проще вырезать и выбросить, оставив не тронутой основную часть мицелия.

 

Работы по выделению чистой культуры, должны проводиться в стерильных условиях! Берем чашку Петри, в которой произошло заражение,

 

входим с ней в стерильное помещение, протираем все поверхности спиртом, погружаем скальпель в спирт, прокаливаем его над пламенем горелки, снова погружаем в спирт, подносим к горелке, и тут же (пока горит спирт), несем его к чашке Петри.* *Смотри фото аналогичных действий при работе с инокуляционной петлей. Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), вырезаем скальпелем кусок агара, с растущей на нем плесенью,

подцепляем его кончиком скальпеля и удаляем.

 

 

Чашку Петри с удаленным очагом заражения оборачиваем пищевой пленкой и убираем в темное, теплое место, на весь период инкубации.* *Смотри фото аналогичных действий при проведении инокуляции.

Если заражения посторонними микроорганизмами не произойдет, через некоторое время (зависит от того, на какой стадии роста мицелия произошло удаление очага заражения), мицелий полностью освоит поверхность агара.

    2. Пересадка мицелия   В случае, когда посторонняя микрофлора занимает значительную часть, и вырезать ее не представляется возможным, из зараженной чашки Петри извлекают кусочек агара с чистым мицелием, и пересаживают его на новую среду в другую чашку Петри.

Берем чашку Петри, в которой произошло заражение, входим с ней в стерильное помещение, протираем все поверхности спиртом, погружаем скальпель в спирт, прокаливаем его над пламенем горелки, снова погружаем в спирт, подносим к горелке и тут же (пока горит спирт) несем его к чашке Петри.* *Смотри фото аналогичных действий при работе с инокуляционной петлей. Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), вырезаем скальпелем кусочек агара с чистым мицелием

 

подцепляем его кончиком скальпеля

и переносим на новую среду, в другую чашку Петри.

 

Чашку Петри накрываем, подписываем, оборачиваем пищевой пленкой и убираем в темное, теплое место на весь период инкубации.* *Смотри фото аналогичных действий при проведения инокуляции.

Через несколько дней, пересаженный кусочек опушится мицелием, а еще через несколько дней мицелий переберется на новую среду. Если заражения посторонними микроорганизмами не произойдет, через 3-4 недели, мицелий полностью освоит поверхность агара.