Технология клонирования грибов

[PsYho]

Итак ввиду отсутствия теков по клонированию предлагаю тек переведённый мною с сайта mycotopia.net

 

Приступим:

 

Берём здоровый гриб, жалательно сразу после разрыва вуали. не в коем случае не следует использовать аборты. Плодовые тела с коричневыми полосами на стебле не пригодны. Помещаем гриб в прохладное место. Используем стерильный скальпель и пинцет для извлечения части стебля и помещения его в банку с питательной средой (или чашку петри)

 

стерильную часть стебля можно вырезать сделав кольцеобразный надрез поперёк стебля на глубину 1,5 - 2 мм

и затем пинцетом снимаем верхний слой плодового тела как бы очищая банан

 

затем обрезаем чижнюю часть стебля как показано на рисунке

 

потом отрезаем нужный кусок очищеного стебля и помещаем его в банку с питательной средой или чашку петри

 

В течении 2 -3 дня кусочек мицелия "опушится" а примерно через 7 дней станут заметны явные признаки роста мицелия.

 

Свободный перевод by elemenrad

[Лесник2012]

Кто нибудь сразу в банку с пшеницей пробовал сунуть кусочек гриба? и как результат ежели чё?

[Heretic]

и как результат ежели чё?

Ежель чисто всё сделано - то результат!

[BumShiva]

Я много читал буржуйских форумов перед тем как попробовать клонирование. Выбрал для себя вариант, где НЕ НАДО РЕЗАТЬ гриб. Ведь при этом происходит много манипуляций с инструментом. Риск заражения увеличивается с каждым надрезом и касанием. А тем более если чистить "как банан".

Просто берешь ножку. Протираешь спиртом. РАЗРЫВАЕШЬ снизу вверх пополам вдоль волокон. Из верхней части изнутри, примерно где кольцо, скальпелем (конечно прокаленным и т.д.) цепляешь кусо4е4ек и на агар (можно и на зерно).

Никакой синевы как при резке. И риск заражения по минимуму, так как мицелий берешь изнутри.

У меня получилось без каких-либо сложностей.

[Heretic]

Почётно.

Делал по деревенски. Часть ноги - над пламенем аккурат, затем в перекись.

После - в ЧП. Всё было пучком.

Да, это были панеолусы кстати...

[alex_kol]

При таких манипуляциях надо помнить, что внутри гриб практически стерильный, и для максимального успеха надо просто свести к минимуму манипуляции с приборами на открытом воздухе.

То есть если прокаленным скальпелем вырезать сердцевину гриба, то ее можно клонировать легко.

 

Также лучше клонировать молодые плодовые тела.

[Гость]

На мой взгляд вся проблема не в чистоте клонируемой ткани плодового тела, а в проникновении нестерильного воздуха при пересадке на новое место.

 

При условии что лишние бактерии есть только на клонируемой ткане:

Хоть контаминаты и присутствуют на теле гриба, им жрать там нечего, и в итоге они поглощаются мицелием, как и находящаяся рядом питательная среда. Если банку не трясти то бактерии не будут прыгать с зерна на зерно как блохи и не успеют рассеяться до поглощения мицелием. (при условии что зерно правильно приготовлено и в нём не так много свободной влаги между зернами)

 

Хочу попробовать сделать банку с "люком", то-есть в крышке отверстие диаметром пару сантиметров, которое будет в итоге заклеиваться пластырем или хорошим скотчем.

 

1) Ставим банку с зерном над восходящим потоком воздуха (духовка, горелка). Так риск проникновения снизится, за счет того что воздух будет сдувать споры бактерий от нужного места.

2) Открываем "люк"

3) Осторожно кидаем небольшую часть плодового тела (можно перед этим окунуть в перекись, хуже не станет)

4) Закрываем люк и без перетряхивания ставим в инкубатор.

 

При клонировании рост начинается моментально, и в хороших условиях с большой скоростью.

[Heretic]

если прокаленным скальпелем вырезать

У меня всегда было проблема - как остудить инструмент так, чтобы он при этом не стал нестерильным...

У кого какие есть мысли по сему поводу?

[gav]

охлаждение металлических инструментов можно ускорить: вновь окунуть раскалённую часть в спирт (но, ВНИМАНИЕ!!!, при этом нужно быть уверенным, что предыдущий спирт действительно выгорел), охладить в нём, а затем быстро пронести над горелкой, лишь бы спирт успел загореться. Спирт сгорит, не успев нагреть инструмент так же сильно, как газовая горелка.

 

(не обязательно) перед использованием шпателя или петли неплохо на всякий случай прикоснуться ими к поверхности агара, чтобы быть уверенным, что они не горячие.

[Heretic]

(не обязательно) перед использованием шпателя или петли неплохо на всякий случай прикоснуться ими к поверхности агара, чтобы быть уверенным, что они не горячие.

Доходил до того что касался агара а затем пробовал губами... ГОРЯЧО!

А касаться агара - открывать крышку - другой проблемс...

Остановился на петле. Самый энерго не ёмкий инструмент. С малой термо-реактивностью.

[vlnick]

к агару прикасаются не на всякий случай. а чтобы сделать петлю липкой.

а после к ней прилипают лучше споры. и после петлей делается змейка по поверхности агара в чашке.

хотя я и не любил работать с агаром.

и чашки редко пользовал.

а использовал чаще не чашки петри. а бутылочки из под глюкозы. делал косой срез застывания от дна до горловины.

для этого устанавливал под наклоном бутылки.

в бутылочке агара было половина при стерилизации. а при наклоне она как раз давала длинный косой срез поверхность.

в них все было намного стерильнее.

а горловину затыкаете ватой с марле. пробка..

ее же и после через пламя проводите обжигая и снова вставляете.

только стерилизовать надо сразу в бутылке недолго. 45 минут это предел. иначе карамелька..

[Heretic]

а использовал чаще не чашки петри. а бутылочки из под глюкозы. делал косой срез застывания от дна до горловины.

для этого устанавливал под наклоном бутылки...

В лабораториях косяки ставят на длительное хранение культуры.

Более оперативный доступ к поверхности конечно у петри.

Но тут уже кому как нравится. Я получал культуры "косяка " в стандартной лабораторной пробирке на 20 мл.

Площадь поверхности огромная! А вот работа...

Но тут как правило культура не чистится а уже полностью чистая.

Ну и другой вопрос тогда с работой. Просто отрезал и в "бутерброд"...

[vlnick]

Бутылки намного шире чем пробирки. И там удобно работать..

но естественно, что в Петри проще делать разные манипуляции.

особенно, если вам надо очистить культуру.

к примеру, если у вас есть загрязнение, то вы во первых, напомню. не просто споры туда размазываете.а делаете разведения в стерильной воде. один к 10. потом еще эту каплю на снова 10 мл.(условно).

Потом - еще раз и так несколько раз.. чтобы оставить минимальное количество спор и соответственно - проблем.

и капаете.

а потом можно отрезать и выкинуть в чашке Петри те места,где растет не то..

или сверху наложить тонкий слой нового агара и через него прорастет нужная культура, которую и можно будет пересевать еще раз. в бутылке конечно, а тем более в пробирке так работать не получится. но зато можно высевать даже в нестерильных условиях. и никогда не будет заражения. а в чашках - летит зараза со всех сторон..

нужна УФ и хлорка -хлорамин , спирт и спиртовка.

И в бутылке много агара. и можно как верно Еретик написал, поставить на долгое хранение..

ну в разумных пределах конечно.. только лучше ватную пробку замотать пленкой пищевой. чтобы агар не высох.

вытаскивать оттуда можно такой же скарикафикационной петлей. срезая верх агара.

или.. налить туда воды и взболтать.. и просто затянуть после в шприц с очень толстой иглой для переливания крови.. и использовать для инокуляции зерна.

хотя это уже создает новые опасности для заражения..

ну и еще плюс бутылок. агаровой среды много.. при стерилизации не выльются за край и не выкипят как в чашках может быть.. и вода не нальется..

вообщем, есть свои плюсы.. напоминаю, что бутылочки широкогорлые для глюкозы и новокаина 16 на 5 см.

так что у кого руки дрожат и условия не стерильные, это выход вместо чашек Петри. да и достать их проще. придти в любое отделение больницы и подойти к медсестре и попросить вынести пару бутылок пустых.

или самому взять. обычно они стоят после использования в пластиковом корытце на первом этаже перед запасными дверями на вынос санитарами..для сдачи и обмена..

только не используйте физ раствор стерильный. там соль. ничего не вырастет..

[Фил]

А если облучить плодовое тело кварцевой лампой в главбоксе, а потом взять с него клон, прорастет ли культура на питательной среде после такого солярия?

[Heretic]

А если облучить плодовое тело кварцевой лампой в главбоксе, а потом взять с него клон

прорастёт! так как не всё живое лампа "засветит". Пойдёт в рост со стороны "грубины" среза

имхо лучше обработать полосканием в перекиси - не так "жестоко" будет.