Изоляция штамма.

Я говорил это раньше, и это не преувеличение, что с одного засева спор на чашку Петри могут прорасти сотни, если не тысячи под-штаммов (sub-strains). Некоторые из них будут очень быстро колонизировать, некоторые хорошо плодоносят, а некоторые - не плодоносят вообще. Некоторые из них будут образовывать несколько огромных грибов, другие будут давать небольшие грибы или вообще никаких. Некоторые под-штаммы дают множество больших плодов; отыскать эти штаммы и есть наша цель. Все что вам нужно это агар, стерильные чашки Петри, и много терпения.

На первом снимке показан мицелий прошедший 3 переноса (transfer) от начального засева сделанного спорами. Первый перенос должен быть произведен в течение одной недели от момента прорастания. Просто перенесите несколько кусочков "лучшего" на вид мицелия расположенного дальше всего от точки прорастания. Подождите около недели, и повторите эту операцию. На данном этапе еще много под-штаммов, они растут друг на друге, и их трудно различить, лишь белая «масса». К третьему пересеву, вы должны иметь что-то вроде этого.

Вы можете увидеть некоторые "сектора" на картинке выше. Каждый сектор это отдельный штамм (strain). Если вы посмотрите с обратной стороны чашки Петри против света, то с лёгкостью различите каждый отдельный сектор.

Из приведённой выше фотографии видно, что нижняя половина чашки Петри была захвачена одним под-штаммом (sub-strain). Это самый агрессивный мицелий в ЧП, и если оставить так, он бы «сожрал» другие штаммы.

Это то, что происходит при засеве споровой взвесью (мультиспоровый засев). Однако, самый быстрорастущий и доминирующий мицелий не всегда может обладать нужными качествами. Он может даже не быть плодоносным.

Решение заключается в переносе и проращивании каждого штамма в отдельных чашках Петри. Как вы можете видеть, я взял два образцы из наиболее перспективных штаммов в этой чашке.

 

Упрощённый перевод статьи RR c mycotopia.net, также в оригинале это всё можно увидеть и услышать в видео “Let’s grow mushrooms”.

Workman's Psilocybe Cubensis Breeding Method

 

По многочисленным просьбам, метод создания гибридов. Это сильно упрощенная версия с минимальным количеством терминов. Метода требует навыков работы с агаром и осуществима только в пределах одного вида! В этом примере мы скрещиваем штаммы Psilocybe cubensis.

 

Классическое скрещивание требует изоляции и прорастание одной споры обоих предков, а затем два мицелия (монокариот) разных родителей скрещивают в чашке Петри. Это точный и контролируемый способ, но он утомительный и отнимает много времени. Метод требует изоляции много единичных спор и много чашек Петри в надежде на несколько жизнеспособных скрещиваний.

 

Упрощенный метод требует изоляции по крайней мере одного монокариотического мицелия. Чтобы получить такой мицелий я просто заражаю агар небольшим количеством спор (взвесь слабой концентрации прим. превод.). Как только мельчайшие «нити» проросли следует сделать пересев наименьшего кусочка мицелия на свежие чашки. Выберите одну удалённую точку прорастания далеко от «кластеров» (уплотнений). Монокариотический мицелий растет медленно, не образует гифов и не является «ризоморфным» (rhizomorphic), он не может дать плод. Точно определить, что мицелий монокариотический, можно под микроскопом (у монокариотического мицелия мало узловых соединений)

 

Теперь, когда у вас есть ЧП с монокариотическим мицелием, тяжёлая часть позади. Следующим шагом является инокуляция этим мицелием субстрата и его дальнейшее зарастание. Как только субстрат оброс мицелием, вы можете приступить к следующему шагу. Не ждите, что банка зарастёт так быстро, как от мультиспорового засева (multispore) или клонирования.

 

 

После того ваша банка монокариотического мицелия будет готова, скрещивать с родителями №2.

Открыть крышку банки и ввести споры родителей № 2. взвесь должна быть свежеприготовленной (т.к. случайное прорастание спор внутри может образовать дикариот). Перетряхните банку и оставьте зарастать.

 

Что происходит?

 

То, с чего мы начали была банка монокариотического мицелия, но когда мы добавили споры родителей № 2, некоторые из проросших сливаются с монокариотическим мицелием, который становится дикариотическим мицелием на ядерном уровне. По сути весь монокариот становится дикариот путем репликации и перемещения ядер в процессе похожей на цепную реакцию в уже существующей сети мицелия. Так как нет не заросших участков в субстрате, то споры родителей № 2 которые герметизируются не будут иметь достаточно ресурсов, чтобы в дальнейшем произвести грибы.

 

Проводите плодоношение прямо в банке, и все грибы будут сортовые гибриды. Красота этого метода в том что вам нужно напрячься в получении чашки Петри монокариотического мицелия, а далее делать так много скрещиваний, как вам угодно.

 

Важно понимать, что F1 грибы состоят на 50% от каждого из родителей на этом этапе, но споры они производят генетически комбинированные. Это означает, что с отпечатков не будет чистой культуры. Для стабилизации нового штамма необходимо разрастить из F1 спор плоды. Для F2 отпечатков выбирать грибы, которые сохранили нужные вам черты. Вы должны так сделать 5 или 6 последовательных поколений прежде чем штамм можно считать стабильным.

 

originale

В скором переведу Стаметса пару глав о генетике и изолировании.

круто, молодчик!

Стаметса тоже интересно будет

информативно

Спасибо за информацию, очень познавательно... Микроскоп четкий у тебя!!!

Микроскоп четкий у тебя!!!

Ага. А ламинар - типо повседневная дешофка...

оФФтопик

уважаемый nemeth, у тебя есть опыт вегетативного размножения грибов? есть пару вопросов по клонированию

1. какую часть плодового тела лучше использовать?

2. методы сохранения стерильности при засеве?

ЗЫ: буду благодарен за ответы на данные вопросы

 

Ответ:

 

Клонирование грибов

 

Слово "клонирование" ассоциируется для многих со знаменитой овцой Долли, выращенной из клеток другой овцы. Воображение рисует тут же сложную аппаратуру, пробирки с мутной жидкостью и пульсирующие в них части чего-то живого, лаборатории в которых куют жуткие планы потомки Франкенштейна.

 

На самом же деле клонирование является ничем иным, как изъятием клеток из одного живого организма и выведением из них нового. Этот новый организм будет являться гинетически идентичной копией оригинала - позже рождённый близнец, так сказать. Как бы сложен и сомнителен с этической точки зрения не был данный процесс, в случае грибов клонирование является обычным и естественным явлением. Многие наверняка сталкивались с ним: выброшенные в компост части собственноручно собранных грибов, непригодные к готовке, неожиданно проростали новыми грибами.

 

Клонирование, о котором пойдёт речь ниже, является ничем иным, как таким же процессом, взятом под контроль.

 

Итак, потребуется: стирильные чашки Петри с агаром и, собственно грибы (одного будет достаточно). Естественно, не стоит для клонировния оставлять какие-нибудь опята-замухрышки, а наоборот именно те, которые обладают важными для вас в данном случае качествами. Обычно клонирование проходит успешно, даже когда используются грибы, пролежавшие пару-тройку дней в холодильнике, но лучше всего, конечно, пользоваться свежим материалом.

 

Едем дальше. Как только подготовлена "лаборатория" (герметически закрывающийся ящик со стеклом в крышке, лампой накаливания и простой лампой, а кроме того с закрывающимися отверстиями для рук на передней стенке) и руки тщательно дезинфицированы, гриб помещается в яшик. Именно в этой последовательности, а не наоборот!

 

Затем гриб разрывается на две части. При это нужно следить за тем, чтобы не прикасаться ко внутренней поверхности или её краям руками (даже если вы очень постарались при дезинфекции, на руках могут остаться не очень дружелюбные бактерии, которые запросто могут все ваши попытки клонировать что-либо свести на нет). Не советую резать гриб: поскольку наружная поверхность всякого гриба всегда более или менее сильно загрязнена, бактерии могут с лезвием ножа попасть и вглубь грибного тела.

 

Острым, стерилизованным на огне и остуженным на воздухе скальпелем вырезаем как можно маленький кусочек ткани из середины грибного тела (вообще-то не имеет никакого значения, откуда именно вырезается этот самый кусочек - из шляпки или ножки - потому вырежем оттуда, где гриб наиболее толст). Очень важно полностью извлечь ткань изнутри гриба.

 

Некоторые грибы обладают волокнистой структурой и потому с трудом поддаются разрезанию. Проще всего в таких случаях сделать сначала два параллельных разреза перпендикулярно ножке. После этого маленькие части ткани без особого труда извлекаются наружу.

 

Эти частички помещаем по одной в чистые чашки Петри с агаром.

 

Вот и всё. Через три-пять дней грибные нити станут видимыми, а очень скоро из них разовьётся полноценный мицелий, который будет расти точно так же, как и обычный, полученный из спор.

 

Не стану повторять, что всё, связанное с иннокуляцией, должно проходить в стерильной среде. Всегда держите это в голове и одной проблемой станет меньше.

 

http://rotten.splane.ru

 

Еще по теме (или около нее):

 

Название: Введение в генетику грибов

Автор: Ю.Т. Дьяков, А.В. Шнырева, А.Ю. Сергеев

Издательство: Москва. Издательский центр "Academia"

Год: 2005

Страниц: 304, с илл.

Формат: djvu

Размер: 6,57 mb

ISBN: 5-7695-2174-0

Качество: среднее

Язык: русский

 

От издателя

В пособии рассматривается строение грибного генома и его изменения в результате мутационного и рекомбинационного процессов; генетическая регуляция морфогенеза и жизненных циклов; эволюция систем размножения и роль гетерокариоза и вегетативной несовместимости в структуре грибных популяций; прикладные аспекты генетики грибов. Для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению «Биология» и биологическим специальностям.

 

http://depositfiles.com/files/0hlexcowe

 

 

Часть 1. ДРУГОГО материала:

 

ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ГРИБА

 

Культивация грибов это одна из лучших возможностей для наблюдения Жизненного Цикла Гриба во всей его полноте. Жизненный цикл начинается со споры, которая порождает первичный мицелий. Вторичный появляется при скрещивании клеток мицелия произошедших от двух разных спор. Этот мицелий продолжает развиваться вегетативно. Когда вегетативный мицелий созреет, его клетки будут способны на феноменально быстрый уровень деления, на пике которого он возводит плодовые тела грибов. Это последнее функциональное изменение в результате которого он становится третичным мицелием. Эти три типа мицелия представляют собой три последовательные фазы жизненного цикла гриба.

 

Споры большинства грибов генетически гаплоидны (1N) и одноядерны. Это значит что каждая спора содержит в себе одно ядро и половину набора хромосом своего вида. Таким образом у споры есть «пол» в том смысле что для созревания до мицелия способного к произведению потомства ей необходима спора противоположного типа. Сразу после выбрасывания споры представляют собой полностью готовые к прорастанию объёмные «влажные» клетки. Но вскоре начинается их обезвоживание и высыхая стенки клетки свёртываются к центру. В таком виде они смогут находится в состоянии покоя, пережидая сухие сезоны или сильные засухи. Когда погодные условия смягчатся и предоставят достаточный уровень влажности споры снова напитаются влагой и вернутся к прежнему объёму. Только в этом случае возможно прорастание спор.

 

В пределах одного вида структура и форма спор в некоторой степени схожи. Однако если рассматривать споры разных видов то можно заметить значительные отличия. Некоторые гладкие в и имеют форму лимона (род Copelandia, к примеру); многие эллиптические (как у рода Psilocybe); тогда как другие обладают неправильной формой и сложной структурой поверхности (Lactarius или Entoloma). Верхушечные зародышевые поры присутствуют у спор многих грибов и особенно у псилоцибиновых видов.

 

Зародышевая пора это округлое углубление на одном конце споры из которого выпускается гаплоидная ниточка мицелия, называемая гифом. Гиф продолжает расти и разветвляясь образует мицелиальную сеть. При встрече двух генетически взаимодополняющих гифовых сетей в момент соприкосновения стенки клеток входящих в контакт растворяются и происходит обмен цитоплазматическим и генетическим материалом. Эротично это или нет, но это «грибной секс». Весь мицелий появляющийся впредь будет двухъядерным и дикариотическим. Это означает, что в каждой клетке будет содержаться два ядра и полный набор хромосом. За несколькими исключениями, только полностью зрелый (дикариотический) мицелий способен к производству плодовых тел. Обычно дикариотический мицелий быстрее колонизирует субстрат и в принципе более сильный, чем монокариотический. Плодоношение уже принципиально возможно, как только мицелий вступает в дикариофазу. У Psilocybe cubensis период между прорастанием спор и появлением зачатков плодовых тел может занять всего две недели; у некоторых видов Panaeolus это может произойти уже через неделю. У большинства грибов тем не менее на это уходит несколько недель или месяцев.

 

Культиваторы занимающиеся выведением новых штаммов путём скрещивания выделенных односпоровых культур используют как признак для определения зрелости (перехода в дикариофазу) мицелия наличие так называемых спаечных соединений. Спаечные соединения это микроскопические мосты объединяющие две клетки и встречаются они только в дикариотическом мицелии. Спайки можно легко увидеть даже с помощью слабого микроскопа с увеличением X100–400. Не все виды образуют спаечные соединения. (Agaricus brunnescens не образуют, зато почти все виды Psilocybe и Panaeolus образуют). И напротив у мицелия полученного из гаплоидных спор спайки отсутствуют. Эта характерная особенность является бесценным инструментом для исследователя выводящего новые штаммы.

 

Две сети мицелия растущие вместе могут обменяться генетической информацией и образовать новый штамм. Это случается при объединении двух гифальных систем и называется анастомоз. А если пересекаются две несовместимых колонии мицелия, то зачастую в месте их встречи образуется участок подавленного роста. На агаре подобный участок несовместимости будет виден невооружённым взглядом.

 

Когда мицелий начинает плодоносить в его метаболизме происходит несколько радикальных перемен. До этого момента он развивался вегетативно. В вегетативной стадии гифальные клетки накапливают питательные вещества. Удивительно что количество ядер в каждой клетке постепенно увеличивается и иногда даже достигает десяти в момент перед началом образования примордий. Непосредственно перед формированием плодовых тел эти ядра передаются через стенки вновь образующимся клеткам и их количество усредняется до двух на клетку. По-видимому такое увеличение количества ядер является необходимым условием для плодоношения у многих видов грибов.

 

По мере формирования гимениальных пластинок появляется всё больше базидиальных клеток, проявляясь поначалу маленькими пузырьками напоминающими булыжную мостовую. Базидия – это основная цель репродуктивной фазы жизненного цикла гриба. Тем не менее базидии не созревают все сразу. К примеру у вида Panaeolus базидиальные клетки появляются очагами придавая поверхности пластинок пятнистый вид. Клетки из которых образуется базидия обычно двухъядерные, и т.к. каждое ядро содержит одинарный набором непарных хромосом (1N), то клетка является дикариотической. И состав новых базидиальных клеток сходный. В определённый момент времени два ядра базидии начинают движение навстречу друг другу и объединяются в одно целое диплоидное (2N) ядро. Это превращение известно как кариогамия. Вскоре после этого диплоидное ядро претерпевает мейоз в результате которого обычно рождаются четыре гаплоидных дочерних клетки.

 

На поверхности базидии возникают стеригмы – выступы похожие на щупальца, по которым движутся эти ядра. У большинства видов на кончиках этих выступов образуются четыре споры. Споры продолжают развиваться до тех пор пока некое усилие не вытолкнет их в пространство. Сам механизм освобождения споры пока не объяснён учёными. Но наиболее распространённая в микологическом сообществе модель основывается на предпосылке что это происходит из-за пузырька газа образующегося в месте соединения споры и стеригмы. Пузырёк газа надувается и взрывается «отстреливая» спору в полость между пластинками откуда её уносят воздушные потоки. Обычно подобным образом освобождаются и другие споры. Спороношение завершает жизненный цикл гриба.

 

Не у всех видов грибов базидии производят четыре гаплоидных споры. Agaricus brunnescens (= Agaricus bisporus), обычный шампиньон, обладает базидиями с двумя диплоидными (2N) спорами. Это означает, что мицелий полученный из одной такой споры уже полностью готов к плодоношению. Agaricus brunnescens – это только один пример диплоидного биполярного вида. У некоторых Copelandian Panaeoli (сильно синеющие виды рода Panaeolus) две споры и те же условия созревания что и у Agaricus brunnescens. У других видов грибов базидии только с тремя спорами; у некоторых с четырьмя; а у несколько видов, таких как лисичка обыкновенная, на каждую базидию приходится восемь спор!

 

Осведомлённость начинающего грибовода о жизненном цикле значительно упростит первые попытки выращивания грибов. Как только будет достигнуто понимание сути грибной культуры и жизненного процесса этих организмов, культиватор сможет перейти к более сложным и интересным темам, таким как генетика и селекция штаммов. Такой всесторонний подход способствует углублению понимания вопроса и закладывает фундамент для развития инновационного подхода к разведению грибов.

 

Ответвления мультиспоровой культуры

 

Мультиспоровая культура это наименее сложный способ получения жизнеспособного мицелия, но не абсолютно чистого штамма. Прорастая в большом количестве, споры фактически создают множество штаммов, некоторые из которых несовместимы с другими, обладают разными потенциалами роста и нуждаются в различных условиях для плодоношения. Такая смесь штаммов подавляет рост более активных из них. В целом штаммы полученные из спор с большой вероятностью наследуют свойства своих предков. Если родители быстро захватывали субстрат и хорошо плодоносили в лабораторных условиях, то можно ожидать схожего поведения и от потомства. Культуры же полученные от дикорастущих образцов напортив в искусственных условиях обычно плодоносят плохо. Как и в случае с дикорастущими растениями, штаммы дикорастущих грибов необходимо совершенствовать селекцией.

 

Из многих штаммов получаемых из спор некоторые могут быть способны только на вегетативный рост. Такой мицелий может усваивать питательные вещества, но не способен образовывать плодовые тела (следствие генеративного роста). Клеточная сеть растущая из единственной споры называется монокариотической. Монокариоты не способны к производству спорообразующих плодовых тел. При встрече и слиянии двух совместимых монокариотов происходит обмен цитоплазматическим и генным материалом. Полученный в результате дикариотический мицелий уже может производить плодовитое потомство. Сетеобразное объединение ветвей различных дикариотических штаммов называется анастомоз. Такая рекомбинация возможна на любой стадии выращивания мицелия: на агаре, зерне, или уже в бедном субстрате. Подобные пересечения грибных штаммов аналогичны созданию гибридов в садоводстве.

 

Другой способ создания культуры заключается в выделении отдельных спор разбавлением в объёме стерильной воды. Далее эта споровая взвесь разводится ещё бóльшим количеством стерильной воды, которое уже в свою очередь и используется для инокуляции чашек с носителем. В этом случае культиватор получает возможность наблюдать за отдельными монокариотами и самостоятельно управлять процессами слияния для выведения высокоурожайных штаммов. Плодоводы нуждающиеся исключительно лишь в получении жизнеспособных культур эту технику могут опустить, т.к. их должно полностью удовлетворить мультиспоровое разведение. Но для тех, кто заинтересован в скрещивании монокариотических штаммов и изучении характеристик получаемых таким образом культур, этот метод окажется бесценным. Помните, что из сотни спор прорастает в среднем от одной до пяти.

 

Наибольшая опасность в приготовлении концентрированных мультиспоровых взвесей скрывается в увеличенной вероятности заражения, особенно бактериального. Некоторые бактерии паразитируют на клеточных оболочках мицелия, тогда как другие стимулируют прорастание спор для дальнейшего перемещения и медленного переваривания самого мицелия. Поэтому некоторые штаммы нездоровы изначально и обычно ассоциируются с высоким уровнем заражений. При попытке прорастить споры в очень большом количестве, те из них что уже инфицированы увеличивают вероятность распространения болезни на соседние.

 

Многие грибы, тем не менее, образуют уникальные симбиотические связи с другими микроорганизмами. Как ни удивительно, некоторые бактерии и дрожжи стимулируют развитие спор, которые в случае стерильной культуры было бы сложно прорастить. Споры Cantharellus cibarius, обычной и высоко ценимой лисички, не прорастали в искусственных условиях, противостоя усилиям лучших микологов мира. Но относительно недавно шведский миколог Nils Fries (1979) установил, что при добавлении в среду активированного угля и красных дрожжей (Rhodotorula glutinis (Fres.) Harrison) споры вскоре успешно прорастают. (Использование активированного угля рекомендуется для любых грибов с затруднённой всхожестью спор.)

 

Многие плодоводы сообщают, что определённые культуры пышно разрастаются при случайном заражении или намеренном внесении бактерий. Было установлено что Pseudomonas putida, Bacillus megaterium, Azotobacter vinelandii и некоторые другие микробы оказывают схожий эффект на различные виды грибов — и на прорастание спор, и на рост мицелия или образование плодовых тел. Однако большинство контаминантов с которыми приходится сталкиваться при разведении грибов, перенесены ли они воздушным путём или уже находились на спорах, делу не помогают. Из всех конкурентов наиболее пагубны бактерии. Прилежное соблюдение норм лабораторной гигиены, использование HEPA-фильтров и правильные методы лабораторной работы призваны справится с этой напастью.

 

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ ИЗ ЖИВОЙ ТКАНИ

 

Культура из ткани является гарантированным способом сохранения соответствующих генетических признаков конкретного гриба. Мицелий полученный из ткани в точности клонирует образец, тогда как мультиспоровая культура образует новый штамм. Ткань для клонирования гриба необходимо брать в течении 24–48 часов с момента сбора. Выделение чистой культуры вызовет затруднения, если образец уже пролежал несколько дней, слишком сухой или перезрелый. С другой стороны споры сохраняются в течение долгого времени.

 

Так как весь гриб состоит из уплотнённого мицелия, то жизнеспособную культуру можно получить из любой части плодового тела гриба. Шляпка, верхняя часть ножки и/или область где пластинки соединяются с нижней частью шляпки являются лучшими местами для иссечения чистой ткани. Шляпку некоторых грибов покрывает кутикула. Сорвав эту тонкую кожицу также можно взять ткань из мякоти расположенной под ней. Протрите поверхность гриба ватным тампоном смоченным в спирте и удалите всю грязь и повреждённую внешнюю ткань. Надломите шляпку или ножку гриба, обнажая его внутренние гифы. Незамедлительно разогрейте скальпель докрасна и остудите его в чашке Петри со средой. Теперь надрежьте мякоть и извлеките маленький кусочек ткани гриба. Перенесите этот фрагмент ткани в центр чашки Петри с питательной средой как можно быстрее, избегая продолжительного контакта как ткани так и агара с открытым воздухом. Повторите все действия и поместите культуру ещё в три или ещё лучше пять чашек. Пометьте каждую чашку видом гриба, датой, типом культуры (ткань) и разновидностью агаровой среды. При благоприятном стечении обстоятельств по прошествии от трёх до семи дней рост мицелия будет очевиден.

 

10% – это общесредний уровень заражений, с которым грибовод может смириться. Тем не менее в первичных культурах, когда образцы берутся от диких видов, не будет чем-то необычным уровень контаминации в 25%. Разнообразные и красочные заражения появляются обычно недалеко от точки пересадки на агар. Количество появившихся контаминантов зависит от чистоты образца ткани или спор, а также от гигиенический условий лаборатории. В культуре клонированной из ткани гриба чаще всего встречаются бактериальные заражения.

 

Заражение это факт жизни каждого грибовода. Контаминанты только тогда становятся проблемой, когда их количество увеличивается сверх всяких разумных пределов, что можно считать признаком грядущей катастрофы в лаборатории. Если пять, десять или даже пятнадцать процентов можно считать нормальным уровнем контаминации для любого культиватора, то резкий скачок без каких-либо видимых изменений в условиях поддержания гигиены может стать причиной для поисков новых способов борьбы.

 

Как только ткань покажет признаки роста её следует переместить в другую чашку. Если нет явных признаков заражения, то быстрая пересадка не столь необходима. Если по соседству уже развивается плесень и готовится выбросить споры, то культуру следует сразу же изолировать. Продолжайте переносить культуру, отделяя её от контаминантов, пока не получите чистый штамм. Очевидно что выделить мицелий из частично заражённой культуры гораздо сложнее, чем пересадить из чистой. Попытки изолировать мицелий от соседствующих контаминантов усложняются опасностью распространения их спор. К тому же незримо для нас, когда мы поднимаем крышку чашки Петри в неё врывается внешний воздух и споры плесени разносятся его потоками в атмосферу лаборатории. Таким образом, чем быстрее культиватор обретёт независимость от инфицированных чашек, тем скорее сможет вывести чистую культуру. Тем не менее помните, что не смотря на то что невооружённому глазу культура может казаться чистой, в ней всё ещё могут скрываться споры контаминантов. Присутствие затаившихся плесеней или бактерий в мицелии станет видимым только тогда, когда вы инокулируете им стерильное зерно.

 

Различные меры могут быть предприняты для минимизации уровня заражения в лаборатории. Мы уже обсудили применение распыляемого масла, HEPA-фильтров и главбоксов. Но ваше личное отношение к заражению и чистоте в лаборатории много важнее любой её части. Авторам случалось видеть высокотехнологичные лаборатории с высоким уровнем контаминации и чуланы с относительно низким. Дадим два совета придерживаясь которых начинающие культиваторы должны преуспеть:

 

1. Приложите максимум стараний к первой попытке создания стерильной культуры. Всё должно быть чисто: лаборатория, одежда, инструменты и особенно сам культиватор.

 

2. Получив чистую культуру примените максимум усилий для поддержания её чистоты. Сохраняйте только те чашки Петри, в которых нет признаков плесени или бактерий. Выбрасывайте все инфицированные чашки, несмотря на то что они могут быть заражены только частично.

 

Не отчаивайтесь если столкнётесь с неудачей после первой попытки. Работа со стерильными культурами пойдёт просто и гладко, но только после некоторой практики, когда вы наберётесь немного опыта.

 

Работа с агаром это только первый шаг в разведении грибов. Для выращивания грибов сам по себе агар непрактичен. Его преимущества для работы с грибной культурой заключаются в возможности быстро разрастить мицелий из малейшего кусочка ткани. И достаточно легко поддерживать чистоту такой культуры, т.к. любое заражение легко заметить на плоской поверхности агаровой среды в чашке Петри.

 

Продолжение (Часть 2):

 

СЕГМЕНТИРОВАНИЕ: СЕЛЕКЦИЯ И УЛУЧШЕНИЕ ШТАММОВ

 

Захватывая поверхность агара мицелий демонстрирует поразительное разнообразие форм. Некоторые культуры довольно однообразны на вид, тогда как другие поначалу проявляя полиморфность (неоднородность) позже неожиданно развиваются в гомогенный (однородный) мицелий. В этом природа мицелия – непрерывно изменяться и эволюционировать.

 

Мицелий называется сегментированным, когда развиваясь из единственной точки инокуляции в разные стороны он показывает разные типы роста. Сегмент определяется исключительно по внешнему виду контрастирующему с окружающим преобладающим типом мицелием. Существует два основных типа роста мицелия: ризоморфный (корнеобразный, нитевидный) и войлочно-опушённый (ватный, облачками). К тому же встречаются и промежуточные типы линейного роста, ориентированные относительно радиальных направляющих (к стенкам чашки), но не имеющие выраженных скрученных нитей или переплетённых гифов характерных для ризоморфного типа роста. Ризоморфный мицелий более предрасположен к образованию примордий. Линейный мицелий тоже склонен к обильному образованию примордий, но делает это обычно после того как преобразуется в ризоморфный. Однако не забывайте о том, что характеристики внешнего вида плодоносящего мицелия так же зависят о разновидности гриба и могут немного отличаться от приведённых выше.

 

В чашке плотно поросшей ватным мицелием, веероподобная веточка жилистого мицелия будет называться ризоморфным сектором, и наоборот. Сегментирование очень часто встречается на культуре грибов, но так же очень мало известно о назначении и причинах появления сегментов. Очевидно, что большую роль в этом играют генетические свойства, возраст мицелия и состав питательной среды.

 

Согласно Stoller (1962) рост пушистых сегментов обусловлен присутствием в субстрате взорванных или сломанных зёрен, которые увеличивают содержание крахмала в носителе грибницы. Работая с Agaricus brunnescens Stoller заметил, что рост мицеля быстрее при высоких значениях pH (7,5), чем при отклонении pH в кислотность (6,5), но сегментирование случается чаще. Он выяснил что сегментирование на зерне можно сократить, уменьшив количество раскрывшихся зёрен (результат наличия избыточной влаги), и понизив pH до 6,5 используя комбинацию мела (углекислый карбонат кальция) и гипса (сульфат кальция).

 

Коммерческие грибоводы давно заметили, что медленно растущий ватный мицелий уступает более быстрому ризоморфному. Существует несомненная зависимость между пушистым видом мицелия на агаре и последующим образованием «стромы», плотного сплетения гифов мицелия покрывающего кейсинг, через которое редко прорастают грибы. Кроме того, примордии чаще образуются на ориентированном на плодообразование ризоморфном, нежели на склонном к вегетативному росту ватном мицелии. И ещё один интересный факт: при наблюдении под микроскопом гифы ризоморфного мицелия выглядят более толстыми и менее разветвлёнными, чем у ватного.

 

Ризоморфный мицелий быстрее захватывает субстрат, образует больше примордий и в результате лучше плодоносит, чем пушистый мицелий. Это видно на Фото 37. Ломтик был пересажен на агар и из него выросли два различных типа мицелия. Сегмент с нитевидным ростом образовал многочисленные примордии, тогда как на ватном мицелии ничего не появилось – такое часто случается на агаре.

 

По мере роста мицелий постепенно начинает стареть. Стареющий мицелий, как и любое пожилое растение или животное, гораздо менее жизнеспособен и плодовит, чем молодой. Вообще превращение мицелия из нитевидного в ватный служит сигналом начала вырождения штамма. Если культура изначально ризоморфная со временем начинает сегментироваться, существует несколько способов предотвращения деградации штамма и сохранения ризоморфизма.

 

1. Производить пересадку только ризоморфных секторов и избегать ватных.

2. Регулярно меняйте питательный носитель используя приведённые здесь формулы. Не желательно использовать одну и ту же агаровую среду, т.к. питательный состав носителя выборочно воздействует на возможность выработки различных пищеварительный ферментов грибным мицелием. Изменение компонентов среды позволяет сохранить широкую ориентированность пищеварительной системы и повысить выживаемость мицелия. Виды сильно отличаются по своим предпочтениям. И если у вас нет определённых данных на этот счёт, то вам придётся идти путём проб и ошибок.

3. Получив количество мицелия необходимое для производства грибницы верните штамм на хранение до следующего использования. Не ждите что мицелий росший несколько лет при оптимальных температурах сохранит свойства первоначальной культуры из которой он был получен. Вследствие многочисленных делений клеток и непрерывных пересадок с большой вероятностью выделился подштамм, который имеет отдалённое сходство с жизнеспособностью, внешним видом и потенциалом плодоношения оригинала.

4. Если все усилия направленные на сохранение жизнеспособного штамма провалились, следует выделить новый из мультиспоровой культуры.

5. Другой альтернативой являются постоянные эксперименты с целью создания гибрида штаммов скрещивая дикариотические мицелии двух генетически отличающихся родителей. (Однако эксперименты с Agaricus brunnescens показали что большая часть гибридов плодоносит меньше, чем кто-либо из задействованных в скрещивании штаммов. И лишь меньшая их часть даёт хорошие урожаи.)

 

Домашние культиваторы могут выборочно развивать штаммы грибов выбирая мицелий по следующим нескольким признакам:

 

1. Ризоморфизм – быстро развивающийся и разрастающийся мицелий

2. Чистота штамма – отсутствие ватных секторов.

3. Чистота мицелия – отсутствие конкурирующих микроорганизмов (бактерий, плесеней и клещей).

4. Время задержки реакции в ответ на создание условий благоприятствующих образованию примордий.

5. Количество появившихся примордий.

6. Коэффициент прорастания появившихся примордий.

7. Размер, форма и/или цвет плодовых тел.

8. Общий урожай.

9. Сопротивляемость заболеваниям.

10. Чувствительность/переносимость C02.

11. Температурные ограничения.

12. Простота сбора урожая.

 

Используя эти характерные особенности, грибные селекционеры смогут разумно оценить качество штаммы и со временем научатся выбирать из них те, которые наилучшим образом соответствуют их предпочтениям.

 

Интересная переписка со шрумери нл. ссылка, но. там - половина воды и сообщений (их характеризует последнее сообщение "депрессия") :

 

 

назрел вопрос, пока не нешел разумительного ответа

 

рассмотрим явления -

 

Петя неизвестным способом завладел принтом, скажем Тичеров , взял Петя и весь принт упрятал в одну банку с зерном . Банка заросла и, после кейсинга, дала плодовые тела . Петя получил N новых принтов Тичера. Тут у Пети случился вруб и он отправил принты по почте всем кто попросил . Таким образом принт оказался и у Васи , ... Вася сделал то же самое что и петя - выростил с мультиспоры - и получил новые принты - далее Вася отослал - Саше , Саша повторил(а) действия Васи , .. и так предположим несколько раз... вот вопрос !?!? что стало со стрейном , с его генотипом , не приблизилась ли она к дикому виду или ещё какие варианты, вырождение например.. если кто ещё и механизм сможет обьяснить так и вообще ведь золото !!!

вот интересно всётаки кто приведёт научные доводы ...

нада учитывать условия обитания - ОБЯЗАТЕЛЬНО , как единственный естественный фактор ограничивающий биологическую потентность генотипа. и условия скрещивания и веги мультиспоры

аргумент про выживание самых живучих спор могу легко опрокинуть аргументом - это споры холят и лелеят под антибиотиками и садт на пшеницу из раза в раз или на перловочку , ням ням , а ещё круче на агар с картошечкой и кукурузой .. :"": так шо не убедительный аргумент ,.. только научные факты ...

я вот немного уже нашел но этого маловато -

 

 

вот если интересно .... нашел....

Ключевую роль в этой системе играют два несцепленных (расположенных на разных хромосомах) генетических фактора (A и , каждый из которых содержит несколько генов. У каждого фактора существует множество аллельных вариантов (1, 2, 3 и т.д.). Скреститься между собой могут только потомки мейоспор, имеющих разныеаллели обоих факторов. В результате получается как бы огромное множество «полов», причем для каждого «пола» имеется широкий набор «разрешенных» партнеров и несколько менее широкий круг партнеров «запрещенных».

Допустим, родительский дикариотический мицелий имеет генотип A3A5B1B6. В результате мейоза в плодовых телах, образованных таким мицелием, сформируется 4 типа мейоспор: А3В1, А3В6, А5В1, А5В6. Чтобы скрещивание было возможно, оба фактора должны различаться по своему аллельному состоянию. Поэтому вероятность успешного скрещивания между «потомками» (мейоспорами) одного и того же мицелия составляет 25% (какую бы мейоспору мы ни взяли, выясняется, что она может скреститься только с одним из четырех типов мейоспор, имеющихся в потомстве данного мицелия, например А3В1 может скреститься только с А5В6). Однако если мейоспоры происходят от разных родителей, то вероятность успешного скрещивания оказывается близкой к 100%, потому что в популяции много аллельных вариантов каждого фактора, и вероятность, что аллели случайно совпадут у разных мицелиев, обычно невелика.

Вот так и определяют «границы индивидов» у высших базидиомицетов: скрещивают между собой мейоспоры, полученные от двух плодовых тел, и определяют процент успешных скрещиваний. Если он близок к 25% - значит, оба плодовых тела принадлежат одному «индивиду», если он близок к 100% - значит, перед нами разные «особи». Довольно изнурительное занятие, но оно позволило получить крайне интересные и неожиданные результаты.

 

Жизненный цикл гриба Neurospora crassa (из группы сумчатых грибов, или аскомицетов). Рисунок из статьи Т. Потаповой «Тайны нейроспоры» http://www.sciam.ru/2004/9/biology.shtml

 

Например, оказалось, что некоторые индивидуумы осеннего опенка могут занимать несколько гектаров леса, иметь массу в несколько тонн и возраст в полторы – две тысячи лет!

Для большинства грибов, однако, вместо понятия «особь» пользуются термином «генет» – так обозначают генетически дискретные единицы, аналогичные клонам в микробиологии. Генеты возникают в результате гибридизации и последующего вегетативного (бесполого) размножения.

Вид

Провести границу между видами у грибов ничуть не легче, чем между индивидами. Морфологический критерий работает плохо: у грибов, как стало ясно в последние десятилетия, полным-полно видов-двойников, то есть форм, внешне практически неотличимых, но никогда не скрещивающихся друг с другом. С другой стороны, многие виды очень полиморфны, и внешние различия между штаммами одного и того же вида могут быть куда выразительнее, чем межвидовые различия. В классификации грибов в последнее время основную роль играют биохимические и генетические критерии.

Видообразование

У грибов чаще, чем у животных и высших растений, происходит симпатрическое видообразование – разделение одного исходного вида на два без географической изоляции (в пределах одного и того же ареала). При симпатрическом видообразовании «дочерние» виды обычно тем или иным способом делят между собой экологические ниши. Например, исходная популяция гриба Fusarium oxysporum, живущего на хлопковых полях, подразделилась на два близнецовых вида, один из которых специализировался на жизни в почве, а другой – на паразитировании в тканях хлопчатника. У гриба Rhizoctonia solani процесс видообразования еще не завершен. Исходная, предковая группа штаммов встречается в целинных почвах и может скрещиваться с другими группами штаммов – своими потомками, которые стали высокоспециализированными паразитами разных сельскохозяйственных растений (картофеля, сахарной свеклы и др.) и уже не могут скрещиваться друг с другом. Среди штаммов этого гриба, избравших в качестве жертвы сахарную свеклу, произошло дальнейшее разделение уже по стадиям развития хозяина: штаммы, поражающие корни сахарной свеклы на ранних стадиях роста, утратили способность скрещиваться со своими родственниками, паразитирующими на корнях взрослого растения. Представители известного рода Pleurotus (вешенка) «разошлись» по погодным условиям: одна группа штаммов, выделенная в вид P. ostreatus, образует плодовые тела осенью, после первого похолодания, а другая (P. pulmonarius) плодоносит летом. Судя по высокому уровню генетического сходства, эти виды разделились совсем недавно.

Генетические механизмы видообразования

Главным условием симпатрического видообразования является формирование репродуктивной изоляции. Иными словами, чтобы превратиться в самостоятельные виды и получить возможность хорошо приспособиться к разным экологическим нишам, стабилизировать свой генофонд, «расходящиеся» популяции должны каким-то образом ограничить генетический обмен друг с другом.

Этого трудно добиться при существовании жестких запретов на скрещивание с близкими родственниками. И действительно, у многих грибов, имеющих половой процесс, симпатрическое видообразование сопряжено со снятием запрета на скрещивание между потомками одного и того же мицелия. Это, конечно, ведет к росту инбридинга (близкородственных скрещиваний), но зато позволяет отказаться от смешения с «чужаками». Снятие запрета на инбридинг (переход от «гетероталличности», или двудомности, к гомоталличности) может сопровождаться потерей части аллелей факторов спаривания или избирательной гибелью некоторых генетических категорий гамет или мейоспор. Часто наблюдается также «псевдогомоталличность» - ситуация, когда грибы, чтобы выработать способность к «самооплодотворению» в обход имеющихся запретов, связанных с факторами спаривания, начинают производить двуядерные мейоспоры, гетерозиготные по факторам спаривания. Из такой мейоспоры сразу, без всякого полового процесса, вырастает дикариотический мицелий, способный к образованию плодовых тел.

Есть и еще более хитрые приемы – например, кассетный механизм переключения типов спаривания, обнаруженный у некоторых сумчатых и базидиальных грибов. В этом случае в геноме имеются кассеты с последовательностями ДНК, гомологичными факторам спаривания. Мейоспора может осуществить сайтспецифичную генную конверсию – иными словами, заменить последовательность ДНК в своем факторе спаривания на другую, взятую из кассеты, и тем самым изменить свой «пол» (тип спаривания). Это дает ей возможность спариваться с другими мейоспорами, произведенными тем же родительским мицелием, которые не осуществили такую же конверсию в своих геномах.

Самым радикальным средством ограничить приток «чужих» генов в генофонд формирующегося вида является полный отказ от полового процесса. Так возникают агамные виды грибов. Одной из причин утраты полового процесса может быть обычный генетический дрейф – случайная утрата популяцией некоторых аллелей факторов спаривания (например, на другой материк может быть случайно занесена грибная спора, из этой споры может со временем развиться бесполым путем большая популяция, но спариваться этим грибам будет не с кем).

Однако утрата полового процесса еще не означает для грибов полного прекращения генетического обмена с другими особями. Остается еще одна возможность – возникновение анастомозов (мостиков) между рядом растущими гифами. Клеточные ядра могут мигрировать по мостикам из одного мицелия в другой, что приводит к обмену генетическим материалом («парасексуальный процесс»).

Этот вид генетического обмена между штаммами ограничивается особыми генами вегетативной совместимости (v-c, vegetative compatibility). Если ядра слившихся клеток несут разные аллели этих генов, гибридная клетка погибает. Получается эффект, обратный тому, который достигается благодаря генам – факторам спаривания. Факторы спаривания препятствуют скрещиванию со «своими», а гены v-c, наоборот, не позволяют обмениваться генетическим материалом с «чужими». Ю. Т. Дьяков подчеркивает, что вегетативная несовместимость по своим функциям сходна с иммунной системой (узнавание «чужого» штамма и гибель слишихся клеток), и поэтому можно считать, что у грибов впервые возникли механизмы симпатрического видообразования, основанные на эксплуатации простейшей иммунной системы.

ВалераНатуралист

вот для начала жизненный цикл базидиальных грибов:

суть: гаплоидная спора(n) прорастает в гаплоидный мицелий(n+,n-), затем мицелии n+ и n- срастаются(половой процесс) образуя диплоидную(почти) клетку(2n), из неё разрастается уже знакомый нам мицелий, образуются плодовые тела(2n) из них уже гаплоидные споры (n)

 

Теперь про Петю, допустим у Пети был дикий предок, в результате передач, у Иакова и Авраама, (через 10 лет гровинга) вырастают совсем разные грибы, у Иакова большие, но подвержены частым заражениям, у Авраама растут под кроватью, но мелкие и слабопрущие.

в ходе гровинга накопились разные мутации, произошло расщепление , образовались чистые линии. Исааков же гровил грамотно(юзал агар) и производил селекцию, у него выросли большие, вкусные, сильные шляпы.

чем дальше мы гровим ограниченный генофонд(в силу наличия летальных генов для выживания человеческой популяции необходимо 30 000 особей), тем быстрей он вырождается и изменяется.

накапливаются нехорошие мутации(слава Богу как правило в рецессивном состоянии).

чтобы убрать их действие можно взять принт у Авраама и Иакова, смешать их, и загровить, гаплоидный мицелий будет стремится расти в сторону другого стрейна(природа стремится к разнообразию), в итоге в первом поколении мы получим более сильные и устойчивые грибы(гетерозис).

во втором поколении из тех же грибов пойдёт уже расщепление и будет компот.

Если клонировать один и тот-же гриб то рано или поздно в нём накопятся вегетативные мутации, они как правило тоже не гуд(хотя бывают и полезные, так например были получены антоновские яблоки, размножить их можно только черенками)

 

но у базидио мицетов есть некоторые особенности, во время полового акта, при срастании гаплоидных мицелиев не происходит объединение ядер, и вместо настоящей гаплоидной клетке(2n) мы имеем дикориотическую (n+n), как-бы два гаплоидных вместе, полностью они объединяются только на стадии образования спор, и тут же разрушаются(производи споры)

взаимодействие генов между двумя ядрами(n+n) менее предсказуемо чем в диплоидной(2n).

так-же если учесть что каждый признак завесит не от 1 гена , а как правило от 30, или более, да и споры, не семечки, сыпят миллионами, поштучно не поработать, эффективность полового отбора у грибов = чистая случайность.

 

возможно, работа с агаром в течении нескольких (сотен?) поколений грибов приведёт к появлению нового, устойчивого стрейна.(но одним клонированием не отделаться)

О йопта !!! ДРУГОЕ ДЕЛО ! наш человек ,. спасибо коллега . Теперь у меня по этому поводу устойчивая картинка.

Тада , в ходе домашних разработок -будет целесообразно при каждом грове мультиспоры подбавлять в новые принты старых спор этого же стрейна... так ?

целесообразно при каждом грове мультиспоры подбавлять в новые принты старых спор этого же стрейна... так

Примерно так.(стерильность старых принтов постоянно понижается), по этому для дома можно вообще не парится за такие упражнения.

дело в том что мульти спора на то и мульти спора, что их там сотни тысяч, и мицелий выращенный из мультиспор, это не один организм, а тысячи(ну может поменьше , но десяток то есть), просто растут вместе, целесообразна в этом плане работа с агаром, так как позволяет отделить шлак.

а добовлять старых спор , если ты говил пару покалений эффекта не даст, слишком мало времени проходит, а вот променятся с Петей принтом, и смешать свой и Петин, может результат поинтересней быть... но если ты собрался селекцией заниматься, то без агара не прокатит один фиг. мультиспора :pardon:

radost

Вырождается он, где то тут было про 5 раз клонирований, я так свои первые грибы извел, они стали здоровыми но перестали торкать даже сьедая 100 гр сырых :no: Я тоже наивно полагал что пееред кейсингом с одной еще три зафигачил и зашибись. :WhiteVoid_1: спору с агара там ниточку , это окультуривание , а генетика нам не доступна, если тока фарой жарить чтоб гены побить :unknown:

 

Violette спасибо

Прочел много интересного, но много мне так и не понятно осталось, в виду некоторой неграмотности в терминологии Так вот интересно стало. Допустим берём стрейн Кубенсис Мексикана и помучившись получаем монокариот. Пересаживаем его в банку на зерно и ждём пока захватит всё. Затем берём полноценный мицелий стрейна Альбино Пенис Энви, потому как монокариота от него хрен знает как добыть , и подсаживаем к монокариотному Куб. Мексу. Вот в таком раскладе провзаимодействуют они ? Может таким образом получиться новый субстрейн или гибрид ?

Прочел много интересного, но много мне так и не понятно осталось, в виду некоторой неграмотности в терминологии Так вот интересно стало. Допустим берём стрейн Кубенсис Мексикана и помучившись получаем монокариот. Пересаживаем его в банку на зерно и ждём пока захватит всё. Затем берём полноценный мицелий стрейна Альбино Пенис Энви, потому как монокариота от него хрен знает как добыть , и подсаживаем к монокариотному Куб. Мексу. Вот в таком раскладе провзаимодействуют они ? Может таким образом получиться новый субстрейн или гибрид ?

не совсем верно понял. нужно заразить СПОРАМИ (не проросшими) родителя№2 монокариотический мицелий родителя №1. идея в том что они прорастают на мицелии №1 и сразу с ним скрещиваются, тем самым грибы будут ф1 (50/50) от обоих предков.

сорри за терминоолгию , расчитывалось в ознакомительном характере

нужно заразить СПОРАМИ (не проросшими) родителя№2 монокариотический мицелий родителя №1. идея в том что они прорастают на мицелии №1 и сразу с ним скрещиваются, тем самым грибы будут ф1 (50/50) от обоих предков.

Да. А мы увидим ГЛАЗОМ отличия? Сомневаюсь.

Тут надо на генном уровне проводить исследования...

Но заморочка гуд. Пока думаю что ещё не "устали" наши стрейны.

Но на будущее будем иметь ввиду...

чтоб увидать глазом - следeет брать характерно различные виды. в оригинале Воркман привводит пример получения гибрида из FAlbino и PenisEnvi.

нужно заразить СПОРАМИ (не проросшими) родителя№2 монокариотический мицелий родителя №1

Это я понял, просто интересно стало, будет ли монокариотный мицелий взаимодействовать с немонокариотным?

Вот два мицелия дикариотных так и будут расти сами по себе, и плодоносить тоже. А вот что будет когда монокариот встретит дикариота?

пардон но я хз если узнаю обязательно сообщу)))

А вот что будет когда монокариот встретит дикариота?

 

каждый из них останется при своих интересах, читай монокариот это половина цепочки ДНК (как и у людей в половых клетках, единственные клетки, где неполный набор хромосом) дикариот это полный неделимый ДНК. по простому, вы пытаетесь получить плод поливая спермой женщину, а не яйцеклетку.., по логике дикариот захватит субстрат, как более агрессивный.